Oct3/4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400012-ACT

POU5F1 kodiert den Transkriptionsfaktor Oct3/4, einen zentralen Regulator der Pluripotenz, der die Selbsterneuerung aufrechterhält und zelllinienspezifische Differenzierungsprogramme in menschlichen Zellen unterdrückt. Oct3/4 wirkt mit SOX2 und NANOG zusammen, um transkriptionelle Netzwerke und den Chromatinzustand embryonaler Stammzellen zu prägen, wobei es Signaleingänge wie die TGF-β/SMAD- und die WNT/β-Catenin-Signalwege integriert. Eine strenge Kontrolle der POU5F1-Dosierung beeinflusst Zellschicksalsübergänge während der frühen Entwicklung und der Reprogrammierung, und eine fehlregulierte Expression ist mit stammzellähnlichen Phänotypen und einer veränderten Differenzierungskapazität assoziiert. Diese Eigenschaften machen Oct3/4 zu einem häufig genutzten molekularen Ansatzpunkt, um epigenetische Regulation, transkriptionelle Schaltkreise und Zellidentität zu untersuchen.

Oct3/4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen POU5F1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Oct3/4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des POU5F1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der POU5F1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Oct3/4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native POU5F1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Oct3/4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Oct3/4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem POU5F1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.