Oct3/4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400012-ACT

POU5F1 codifica o fator de transcrição Oct3/4, um regulador central da pluripotência que mantém a autorrenovação e reprime programas de diferenciação específicos de linhagem em células humanas. Oct3/4 coopera com SOX2 e NANOG para moldar redes transcricionais e o estado da cromatina em células-tronco embrionárias, integrando sinais de vias como TGF-β/SMAD e WNT/β-catenina. O controle rigoroso da dosagem de POU5F1 influencia transições de destino celular durante o desenvolvimento inicial e a reprogramação, e a expressão desregulada está associada a fenótipos semelhantes aos de células-tronco e a uma capacidade de diferenciação alterada. Essas propriedades fazem de Oct3/4 uma ferramenta molecular amplamente utilizada para estudar regulação epigenética, circuitos transcricionais e identidade celular.

Oct3/4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de POU5F1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Oct3/4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus POU5F1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição POU5F1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Oct3/4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus POU5F1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Oct3/4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Oct3/4 em células tumorais com expressão de POU5F1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.