NuMA CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401570-ACT

Das humane NUMA1 kodiert für das Nuclear Mitotic Apparatus Protein (NuMA), ein großes Coiled-Coil-Gerüstprotein, das sich an den Spindelpolen anreichert, um die Minusenden der Mikrotubuli zu organisieren und während der Mitose eine präzise Chromosomensegregation sicherzustellen. NuMA kooperiert mit dem Dynein–Dynactin-Komplex sowie mit LGN/Gαi-vermittelten kortikalen Signalwegen, um die Spindel zu positionieren, die Integrität der Spindelpole zu stützen und Zytokinese sowie nukleäre Architektur zu koordinieren. Eine Störung der NUMA1-Funktion kann die mitotische Genauigkeit beeinträchtigen, Aneuploidie fördern und Entscheidungen zur Zellpolarität verändern, was NUMA1 zu einem relevanten Knotenpunkt für Studien zur Genomstabilität und zu proliferationsassoziierten Phänotypen macht. Diese Eigenschaften verknüpfen NuMA mit mechanistischen Untersuchungen in der Krebsbiologie und der Entwicklungszellbiologie, in denen Spindelorientierung und chromosomale Stabilität zentral sind.

NuMA Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NUMA1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NuMA Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NUMA1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NUMA1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NuMA-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NUMA1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NuMA-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NuMA-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NUMA1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.