Plasmide CRISPR d'Activation (h) NPAS2: sc-405236-ACT

La NPAS2 humaine (neuronal PAS domain protein 2) est un facteur de transcription bHLH-PAS (basic helix–loop–helix PAS) qui constitue un composant central de l’horloge circadienne moléculaire. NPAS2 forme un hétérodimère avec ARNTL/BMAL1 afin de se lier aux éléments E-box et de piloter des programmes de transcription rythmiques régissant l’alternance veille–sommeil, le métabolisme, la signalisation hormonale et l’excitabilité neuronale. Par le contrôle transcriptionnel de gènes régulés par l’horloge, NPAS2 intègre des signaux environnementaux et cellulaires à des voies telles que l’entraînement circadien et l’homéostasie énergétique. La dérégulation des réseaux transcriptionnels associés à NPAS2 a été liée à des altérations du comportement circadien et a été étudiée dans des contextes incluant des phénotypes neuropsychiatriques, des traits métaboliques et des perturbations de l’horloge associées au cancer.

NPAS2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NPAS2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NPAS2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NPAS2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NPAS2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NPAS2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NPAS2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NPAS2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NPAS2 dans les cellules tumorales présentant une expression de NPAS2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.