Nox4 CRISPR Activation Plasmid (m2): sc-424443-ACT-2

Das Mausgen Nox4 (NADPH-Oxidase 4) kodiert ein konstitutiv aktives, ROS-erzeugendes Enzym, das vor allem Wasserstoffperoxid produziert und dadurch die Redoxsignalübertragung in zahlreichen Zelltypen prägt. Von NOX4 abgeleitete reaktive Sauerstoffspezies modulieren Signalwege wie TGF-β/SMAD, MAPK, PI3K–AKT und NF-κB und beeinflussen damit Prozesse wie Differenzierung, Umbau der extrazellulären Matrix, Apoptose und Stressantworten; besonders ausgeprägt sind die Funktionen in der Gefäßbiologie, der Nierenfunktion und der Aktivierung von Fibroblasten. Eine dysregulierte Nox4-Aktivität wurde in Mausmodellen mit experimentellen Phänotypen in Verbindung gebracht, die für Fibrose, Hypertonie und vaskuläres Remodeling, Stoffwechselstörungen sowie entzündlich bedingte Gewebeschädigungen relevant sind. Die Geneditierung von Nox4 ermöglicht die mechanistische Aufklärung kompartimentierter ROS-Signalgebung, die Untersuchung redoxabhängiger Transkriptionsprogramme und die Validierung von NOX4-Beiträgen in krankheitsrelevanten zellulären und in vivo-Systemen.

Nox4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m2) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Nox4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Nox4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m2) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Nox4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Nox4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Nox4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Nox4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Nox4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Nox4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Nox4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.