Nox3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402542-ACT

NOX3 kodiert Nox3, eine katalytische Unterheit der NADPH-Oxidase-Familie, die reaktive Sauerstoffspezies (ROS) erzeugt, indem sie Elektronen von NADPH auf molekularen Sauerstoff überträgt. Von Nox3 abgeleitete ROS tragen zu Redox-Signalwegen bei, die Kinasekaskaden, Transkriptionsprogramme und Ionentransportprozesse modulieren können und so die Oxidantienproduktion mit der zellulären Homöostase verknüpfen. Obwohl NOX3 in Säugersystemen klassischerweise mit der Biologie des Innenohrs in Verbindung gebracht wird, ist eine fehlregulierte NADPH-Oxidase-Aktivität allgemein relevant für Mechanismen des oxidativen Stresses, die an Entzündung, epithelialer Dysfunktion und Gewebeumbau beteiligt sind. In humanen Forschungsmodellen können Expression und Aktivität von NOX3 untersucht werden, um kompartimentierte ROS-Signalgebung und deren nachgeschaltete Effekte auf redoxsensitive Signalwege zu verstehen.

Nox3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NOX3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Nox3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NOX3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NOX3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Nox3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NOX3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Nox3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Nox3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NOX3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.