NOS2/iNOS CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400066-ACT

Das humane NOS2-Gen kodiert die induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS), ein entzündungsreaktives Enzym, das aus L-Arginin Stickstoffmonoxid (NO) erzeugt und die Redoxsignalgebung, die Gefäßregulation sowie die antimikrobielle Abwehr moduliert. NOS2/iNOS wird stark durch NF-κB- und JAK/STAT-gesteuerte Zytokin-Signalwege reguliert und kann über nitrosativen und oxidativen Stress den zellulären Stoffwechsel und die Mitochondrienfunktion umgestalten. Eine Fehlregulation der NOS2-Aktivität wird mit chronischen Entzündungszuständen, Wirt–Pathogen-Interaktionen und einer tumorassoziierten Immunumprogrammierung in Verbindung gebracht – unter anderem durch Effekte auf DNA-Schadensantworten, Angiogenese und die Polarisierung von Immunzellen. Als kontextabhängiger Vermittler der NO-Signalgebung wird NOS2 in Makrophagen, Epithelzellen und Krebsmodellen breit untersucht, um Entzündungsschaltkreise und Stressadaptation zu analysieren.

NOS2/iNOS Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NOS2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NOS2/iNOS Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NOS2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NOS2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NOS2/iNOS-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NOS2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NOS2/iNOS-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NOS2/iNOS-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NOS2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.