Nopp140 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402907-ACT

NOLC1 kodiert Nopp140, ein nukleoläres Phosphoprotein der Nukleolen und Cajal-Körper, das als Gerüst für die Assemblierung von Ribonukleoproteinen und den intranukleären Transport dient. Nopp140 ist an der Ribosomenbiogenese beteiligt, indem es die Dynamik von snoRNPs, die Prozessierung der prä-rRNA und die Organisation des Nukleolus koordiniert, und es unterstützt über Interaktionen mit Cajal-Körpern die Reifung spliceosomaler snRNPs. Seine Aktivität wird durch umfangreiche Phosphorylierung reguliert und steht in Verbindung mit RNA-Polymerase-I-abhängigen Transkriptionsprogrammen, Nukleolus-Stressantworten und zellzyklusgekoppelter Wachstumskontrolle. Eine Dysregulation der nukleolären Homöostase sowie von RNA-Prozessierungswegen unter Beteiligung von NOLC1/Nopp140 ist für Studien zu proliferativen Signalwegen, Genomstabilität und stressadaptiver Umgestaltung der Genexpression in menschlichen Zellen relevant.

Nopp140 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NOLC1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Nopp140 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NOLC1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NOLC1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Nopp140-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NOLC1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Nopp140-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Nopp140-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NOLC1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.