Nkx-6.1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401997-ACT

NKX6-1 codifica il fattore di trascrizione homeobox Nkx-6.1, un regolatore chiave della definizione del pattern dell’endoderma pancreatico e della specificazione della linea cellulare delle β-cellule. Nkx-6.1 coordina programmi trascrizionali che sostengono la differenziazione endocrina, la capacità secretoria di insulina e il mantenimento dell’identità delle β-cellule attraverso interazioni con reti di sviluppo fondamentali e la regolazione genica mediata da enhancer. Alterazioni dell’espressione o della funzione di NKX6-1 sono associate a una maturazione compromessa delle β-cellule e a una deregolazione dell’omeostasi del glucosio, rendendolo rilevante per studi meccanicistici sulla suscettibilità al diabete e sul fallimento delle β-cellule. In quanto fattore che definisce la linea cellulare, NKX6-1 è utilizzato anche come marcatore e nodo funzionale nella differenziazione pancreatica derivata da cellule staminali e nelle transizioni di stato delle cellule delle isole pancreatiche.

Nkx-6.1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NKX6-1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Nkx-6.1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NKX6-1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NKX6-1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Nkx-6.1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NKX6-1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Nkx-6.1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Nkx-6.1 nelle cellule tumorali con espressione di NKX6-1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.