Nkx-6.1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401997-ACT

NKX6-1 kodiert den Homeobox-Transkriptionsfaktor Nkx-6.1, einen zentralen Regulator der Musterbildung des pankreatischen Endoderms und der Festlegung der β‑Zell-Linie. Nkx-6.1 koordiniert Transkriptionsprogramme, die die endokrine Differenzierung, die Insulinsekretionskapazität und die Aufrechterhaltung der β‑Zell-Identität unterstützen – über Interaktionen mit zentralen Entwicklungsnetzwerken und enhancervermittelte Genregulation. Eine veränderte NKX6-1-Expression oder -Funktion steht mit einer beeinträchtigten β‑Zell-Reifung und einer gestörten Glukosehomöostase in Zusammenhang und ist damit relevant für mechanistische Untersuchungen zur Diabetesanfälligkeit und zum β‑Zellversagen. Als linienbestimmender Faktor wird NKX6-1 zudem als Marker und funktioneller Knotenpunkt in der aus Stammzellen abgeleiteten pankreatischen Differenzierung sowie bei Zustandsübergängen von Inselzellen verwendet.

Nkx-6.1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NKX6-1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Nkx-6.1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NKX6-1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NKX6-1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Nkx-6.1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NKX6-1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Nkx-6.1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Nkx-6.1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NKX6-1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.