Nkx-2.5 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400276-ACT

NKX2-5 kodiert den Homeobox-Transkriptionsfaktor Nkx-2.5, einen zentralen Regulator der Kardiogenese, der die Spezifizierung kardialer Vorläuferzellen, die Morphogenese der Herzkammern und die Entwicklung des Reizleitungssystems steuert. Nkx-2.5 ist in Netzwerke mit GATA4, TBX5 und MEF2 eingebunden und moduliert Chromatin- sowie Transkriptionsprogramme, die den Aufbau der Sarkomere, den Calciumhaushalt und die Differenzierung von Kardiomyozyten regulieren. Eine fehlregulierte NKX2-5-Aktivität oder -Expression ist mit angeborenen Herzfehlern und Störungen der kardialen Erregungsleitung assoziiert und macht NKX2-5 zu einem Schlüsselpunkt für die Untersuchung der transkriptionellen Regulation der kardialen Linienfestlegung. In humanen Zellmodellen bietet die gezielte Perturbation von NKX2-5 einen gut handhabbaren Ansatzpunkt, um Entwicklungs-Genregulationsschaltkreise und krankheitsrelevante elektrophysiologische Phänotypen zu analysieren.

Nkx-2.5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NKX2-5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Nkx-2.5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NKX2-5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NKX2-5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Nkx-2.5-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NKX2-5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Nkx-2.5-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Nkx-2.5-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NKX2-5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.