NIPBL CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403371-ACT

NIPBL kodiert einen Cohesin-Ladefaktor, der für die Etablierung und Aufrechterhaltung der Kohäsion von Schwesterchromatiden sowie für die höherstufige Organisation des Genoms essenziell ist. Durch die Regulation der Cohesin-Dynamik auf dem Chromatin beeinflusst NIPBL die DNA-Replikation, DNA-Schadensantworten und die weitreichende Enhancer-Promotor-Kommunikation, die zelllinienspezifische Transkriptionsprogramme prägt. Eine Störung der NIPBL-Funktion ist eng mit einer Fehlregulation entwicklungsrelevanter Gene verbunden und stellt eine der wichtigsten genetischen Ursachen des Cornelia-de-Lange-Syndroms dar, wodurch NIPBL einen zentralen Ansatzpunkt für die Untersuchung von Mechanismen der Transkriptionskontrolle bildet. Seine Rolle in der Chromatinarchitektur verknüpft NIPBL zudem mit Signalwegen, die den Zellzyklusverlauf und die Genomstabilität in menschlichen Zellen steuern.

NIPBL Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NIPBL-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NIPBL Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NIPBL-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NIPBL-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NIPBL-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NIPBL-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NIPBL-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NIPBL-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NIPBL-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.