Ninein CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402270-ACT

Das humane NIN kodiert Ninein, ein centrosomales Coiled-Coil-Protein, das am Mutterzentriol und im perizentriolären Material lokalisiert ist. Dort verankert es die Minus-Enden von Mikrotubuli und trägt zur Organisation nicht-centrosomaler Mikrotubuli-Arrays bei. Ninein trägt zur Reifung des Centrosoms, zur Spindelassemblierung, zur Ziliogenese und zur Aufrechterhaltung der Zellpolarität bei, indem es während des Zellzyklus die Dynamik von Mikrotubuli-Nukleation und -Verankerung koordiniert. Über diese Funktionen verknüpft NIN die Integrität des Centrosoms mit der mitotischen Genauigkeit und der Architektur des Zytoskeletts – Prozesse, die bei proliferativen und neuroentwicklungsbedingten Erkrankungen häufig gestört sind. Eine veränderte Ninein-Funktion wurde im Zusammenhang mit Defekten in der ziliären Signalübertragung, der Zellmigration sowie mit Phänotypen chromosomaler Instabilität untersucht, die für die Erforschung von Krankheitsmechanismen relevant sind.

Ninein Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NIN-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Ninein Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NIN-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NIN-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Ninein-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NIN-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Ninein-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Ninein-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NIN-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.