Nicotinic Acetylcholine Receptor gamma/CHRNG CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403321-ACT

CHRNG kodiert die Gamma-Untereinheit des nikotinischen Acetylcholinrezeptors (nAChR), eines ligandengesteuerten Ionenkanals, der in der sich entwickelnden Skelettmuskulatur einen acetylcholinabhängigen Kationenfluss und eine Depolarisation der Zellmembran vermittelt. Der Gamma-haltige Rezeptor ist ein Kennzeichen fetaler bzw. denervierter Muskulatur und wird an reifen neuromuskulären Endplatten durch die Epsilon-Untereinheit ersetzt, was CHRNG mit der Synaptogenese während der Entwicklung und dem Wechsel der Rezeptoruntereinheiten verknüpft. Über seine Beteiligung an cholinerger Signalübertragung und aktivitätsabhängigen Programmen der Muskeldifferenzierung beeinflusst CHRNG die neuromuskuläre Transmission und Erregbarkeit. Pathogene Varianten in CHRNG wurden mit kongenitalen myasthenischen Phänotypen und Syndromen im Zusammenhang mit fetaler Akinesie assoziiert, wodurch es für Studien zur neuromuskulären Entwicklung und zu Krankheitsmechanismen relevant ist.

Nicotinic Acetylcholine Receptor gamma/CHRNG Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CHRNG-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Nicotinic Acetylcholine Receptor gamma/CHRNG Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CHRNG-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CHRNG-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Nicotinic Acetylcholine Receptor gamma/CHRNG-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CHRNG-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Nicotinic Acetylcholine Receptor gamma/CHRNG-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Nicotinic Acetylcholine Receptor gamma/CHRNG-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CHRNG-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.