Plasmide CRISPR d'Activation (h) NHERF-1: sc-404885-ACT

SLC9A3R1 code NHERF-1 (Na+/H+ exchanger regulatory factor 1), une protéine d’échafaudage à domaine PDZ qui organise des récepteurs membranaires, des transporteurs d’ions et des enzymes de signalisation à la membrane plasmique apicale. NHERF-1 module le transport épithélial des ions et des fluides via des interactions avec NHE3 (SLC9A3), CFTR et des RCPG, et relie ces complexes au cytosquelette d’actine par l’intermédiaire des protéines ERM. En coordonnant le trafic des récepteurs et la propagation des signaux, NHERF-1 influence des voies telles que la signalisation cAMP/PKA, PI3K–AKT et des réponses dépendantes du contexte de la voie Wnt/β-caténine. Une expression ou une localisation dysrégulées de NHERF-1 ont été associées à une altération de l’homéostasie épithéliale et à des phénotypes de signalisation pertinents pour la biologie du cancer, la régulation du transport rénal et intestinal, ainsi que les microenvironnements inflammatoires.

NHERF-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SLC9A3R1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NHERF-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SLC9A3R1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SLC9A3R1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NHERF-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SLC9A3R1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NHERF-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NHERF-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de SLC9A3R1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.