Plásmido CRISPR de Activación (h) Neurotensin: sc-401958-ACT

La neurotensina (NTS) codifica un neuropéptido secretado que señaliza a través de receptores de neurotensina para modular la neurotransmisión, la secreción neuroendocrina, la motilidad gastrointestinal y el procesamiento nociceptivo. En tejidos humanos, la señalización de GPCR impulsada por la neurotensina influye en cascadas de segundos mensajeros, incluidas PLC/PKC, MAPK/ERK y PI3K/AKT, vinculando la liberación del péptido con cambios en la excitabilidad celular y en programas transcripcionales. La expresión de NTS está regulada por la actividad neuronal y señales metabólicas, y la alteración de la señalización de la neurotensina se ha asociado con la desregulación de vías dopaminérgicas, señalización relacionada con la inflamación y estados celulares asociados a tumores en múltiples sistemas modelo. Estas características hacen de NTS un nodo útil para estudiar la comunicación mediada por péptidos, la desensibilización del receptor y la reprogramación de vías aguas abajo en contextos relevantes para la enfermedad.

Neurotensin El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de NTS sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Neurotensin El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus NTS en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional NTS, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Neurotensin. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo NTS y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Neurotensin en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Neurotensin en células tumorales con expresión de NTS silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.