Neurofibromin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400625-ACT

NF1 kodiert Neurofibromin, einen großen zytoplasmatischen Tumorsuppressor, der hauptsächlich als Ras‑GTPase‑aktivierendes Protein (Ras‑GAP) wirkt und die Umwandlung von aktivem Ras‑GTP in inaktives Ras‑GDP beschleunigt. Durch diese negative Regulation moduliert Neurofibromin die MAPK/ERK‑ und PI3K–AKT‑Signalwege und beeinflusst dadurch Proliferation, Differenzierung und Stressantworten in verschiedenen Zelltypen. NF1 steht außerdem in Wechselwirkung mit der cAMP/PKA‑Signalgebung sowie mit zytoskelettalen Programmen, die Zellmigration und Neuritenbiologie steuern. Funktionsverlustveränderungen in NF1 sind mit einer fehlregulierten Ras‑Signalwegaktivität verbunden und werden in neuroentwicklungsbezogenen wie auch krebsassoziierten Kontexten intensiv untersucht, was NF1 zu einem zentralen Knotenpunkt für die Erforschung von Signalwegmechanismen macht.

Neurofibromin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NF1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Neurofibromin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NF1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NF1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Neurofibromin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NF1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Neurofibromin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Neurofibromin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NF1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.