Plasmide CRISPR d'Activation (m) nephrin: sc-424905-ACT

Le gène murin **Nphs1** code la néphrine, une protéine transmembranaire de la superfamille des immunoglobulines qui constitue le noyau du diaphragme de fente des podocytes et est indispensable à l’intégrité de la barrière de filtration glomérulaire. La néphrine participe à des complexes multiprotéiques avec la podocine et CD2AP et se relie au remodelage du cytosquelette d’actine via des voies de signalisation incluant PI3K/AKT et les kinases de la famille Src, contribuant ainsi à la survie et à l’architecture des podocytes. Toute perturbation de l’expression ou de la localisation de la néphrine désorganise la structure du diaphragme de fente, entraînant une perméabilité altérée et des phénotypes associés à la protéinurie, largement étudiés dans des modèles de maladies rénales. En tant que marqueur enrichi dans les podocytes, la régulation de **Nphs1** est fréquemment examinée dans des études portant sur le développement glomérulaire, les réponses aux lésions et le maintien de la barrière de filtration.

nephrin Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Nphs1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

nephrin Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Nphs1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Nphs1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de nephrin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Nphs1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de nephrin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie nephrin dans les cellules tumorales présentant une expression de Nphs1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.