NELF-E Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401932-ACT

Il gene umano **NELFE** codifica **NELF-E**, una subunità legante l’RNA del complesso **NELF** (Negative Elongation Factor), che impone una pausa prossimale al promotore della RNA polimerasi II e modella le fasi iniziali dell’allungamento trascrizionale. Coordinandosi con **DSIF** e **P-TEFb**, NELF-E contribuisce a regolare la tempistica della trascrizione, i programmi genici responsivi agli stimoli e il processamento co-trascrizionale dell’RNA, incluso l’accoppiamento con gli eventi al 5′. Questo controllo è centrale in vie che governano la progressione del ciclo cellulare, la differenziazione e le risposte allo stress, in cui dinamiche alterate dell’allungamento possono rimodellare le reti di espressione genica. La disregolazione della pausa trascrizionale e del controllo dell’allungamento, inclusi i componenti del complesso NELF, è stata collegata a programmi di crescita e di linea cellulare aberranti osservati in diversi contesti rilevanti per la malattia, rendendo **NELFE** un nodo utile per studi meccanicistici della regolazione trascrizionale.

NELF-E Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NELFE senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NELF-E Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NELFE nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NELFE, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NELF-E. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NELFE nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NELF-E nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NELF-E nelle cellule tumorali con espressione di NELFE silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.