Nek1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403501-ACT

NEK1 kodiert die NIMA-verwandte Kinase 1 (Nek1), eine Serin/Threonin-Kinase, die an der Kontrolle des Zellzyklus, der Biologie von Zentrosomen und Zilien sowie an der Koordination der DNA-Schadensantwort beteiligt ist. Nek1 wurde mit Signalprozessen in Verbindung gebracht, die die Mikrotubuli-Dynamik, die Checkpoint-Signalgebung und die Genomstabilität durch phosphorylierungsabhängige Regulation zentraler mitose- und reparaturassoziierter Substrate steuern. In menschlichen Zellen ist eine veränderte NEK1-Aktivität mit Defekten der Ziliogenese und einer beeinträchtigten Reaktion auf genotoxischen Stress assoziiert, was diese Kinase mit Signalwegen verknüpft, die die zelluläre Homöostase prägen. Genetische und funktionelle Studien haben NEK1 zudem mit krankheitsrelevanten Mechanismen in Zusammenhang gebracht, darunter Neurodegeneration und genomische Instabilitätsphänotypen im Kontext von Krebs.

Nek1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NEK1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Nek1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NEK1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NEK1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Nek1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NEK1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Nek1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Nek1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NEK1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.