NDH II CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402757-ACT

Das humane DHX9-Gen kodiert die DExH-Box-Helikase NDH II, eine multifunktionale RNA/DNA-Helikase, die Transkription, prä-mRNA-Prozessierung, mRNA-Export, Translation sowie die Aufrechterhaltung der Genomstabilität reguliert. NDH II ist am R-Loop-Stoffwechsel beteiligt und löst strukturierte Nukleinsäuren auf, wodurch es mit der Signalgebung der DNA-Schadensantwort und Signalwegen bei Replikationsstress verknüpft ist. Durch Interaktionen mit Ribonukleoprotein-Komplexen und promotorassoziierten Nukleinsäuren kann DHX9 Programme der angeborenen Immunantwort sowie stressresponsive Genexpressionsprogramme beeinflussen. Eine veränderte DHX9-Aktivität oder -Expression wurde mit einer dysregulierten RNA-Prozessierung und chromatinassoziierter Instabilität in mehreren krankheitsrelevanten zellulären Kontexten in Verbindung gebracht, was seinen Einsatz als mechanistisches Ziel in der funktionellen Genomik unterstützt.

NDH II Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DHX9-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NDH II Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DHX9-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DHX9-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NDH II-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DHX9-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NDH II-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NDH II-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DHX9-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.