NALCN CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403432-ACT

NALCN kodiert das nichtselektive Natrium‑Leckkanalprotein, eine porenbildende Membrankomponente, die eine spannungsunabhängige Hintergrund‑Na+-Leitfähigkeit vermittelt und dazu beiträgt, das Ruhe мемbranpotential und die intrinsische Erregbarkeit in Neuronen und anderen erregbaren Zellen festzulegen. Durch die Feinabstimmung des basalen depolarisierenden Antriebs greift die NALCN‑Funktion in Signalnetzwerke ein, die rhythmisches Feuern, synaptische Integration und die homöostatische Kontrolle des Membranpotenzials regulieren. Eine fehlregulierte NALCN‑Aktivität oder ‑Expression wurde mit neuroentwicklungs- und neuromotorischen Phänotypen in Verbindung gebracht, darunter gestörte Atemrhythmik und Hypotonie, was seine Rolle in erregbarkeitsabhängiger Schaltkreisfunktion widerspiegelt. In humanen Zellmodellen bietet die Modulation von NALCN einen gut handhabbaren Ansatz, um Membran‑Elektrophysiologie, Ionenkanalregulation und nachgeschaltete transkriptionelle Antworten auf veränderte Erregbarkeit zu untersuchen.

NALCN Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NALCN-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NALCN Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NALCN-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NALCN-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NALCN-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NALCN-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NALCN-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NALCN-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NALCN-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.