Plasmide CRISPR d'Activation (h) N-WASP: sc-401440-ACT

WASL code pour la N-WASP humaine, une protéine régulatrice de l’actine multidomaine qui couple la signalisation des GTPases de la famille Rho et des phosphoinositides à la nucléation d’actine branchée médiée par Arp2/3. En coordonnant le remodelage du cytosquelette, N-WASP soutient des processus tels que l’endocytose médiée par la clathrine, la formation de protrusions membranaires et la migration, la dynamique d’adhésion, ainsi que l’organisation de la synapse immunologique. L’activité de N-WASP intègre des signaux provenant de Cdc42, d’adaptateurs à domaine SH3 et de kinases tyrosine afin d’ajuster l’assemblage de l’actine en réponse à des signaux extracellulaires. Un dérèglement de la fonction WASL/N-WASP a été impliqué dans des altérations de la motilité cellulaire et du comportement invasif, dans des phénotypes neurodéveloppementaux liés à la dynamique de l’actine synaptique, ainsi que dans des défauts de signalisation des cellules immunitaires pertinents pour l’inflammation et les interactions hôte–pathogène.

N-WASP Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de WASL sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

N-WASP Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus WASL dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription WASL, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de N-WASP. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus WASL natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de N-WASP au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie N-WASP dans les cellules tumorales présentant une expression de WASL silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.