Plasmide CRISPR d'Activation (h) N-type Ca CP α1B: sc-402397-ACT

CACNA1B code la sous-unité α1B formant le pore des canaux calciques de type N dépendants du voltage (CaV2.2), qui assurent l’influx de Ca2+ déclenché par la dépolarisation dans les cellules excitables. L’ouverture du canal couple l’activité membranaire à la signalisation calcique intracellulaire, en coordonnant l’arrimage des vésicules présynaptiques et la libération de neurotransmetteurs via des voies dépendantes du Ca2+ et des kinases en aval. L’activité de CACNA1B façonne la transmission synaptique, l’excitabilité neuronale et la sécrétion neuroendocrine, et des variations fonctionnelles sont associées à une modification du traitement de la douleur et à des phénotypes neuropsychiatriques. En tant que composant central des réseaux de signalisation dépendants du calcium, CaV2.2 est couramment étudié dans des modèles de physiologie synaptique et de régulation des canaux ioniques.

N-type Ca CP α1B Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CACNA1B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

N-type Ca CP α1B Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CACNA1B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CACNA1B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de N-type Ca CP α1B. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CACNA1B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de N-type Ca CP α1B au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie N-type Ca CP α1B dans les cellules tumorales présentant une expression de CACNA1B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.