N-RAP CRISPR Activation Plasmid (h): sc-408143-ACT

Das humane NRAP-Gen kodiert N-RAP, ein in quergestreifter Muskulatur angereichertes zytoskelettales Gerüstprotein, das den Aufbau von Myofibrillen koordiniert, indem es Aktinfilamente mit α-Actinin-haltigen Strukturen an sich entwickelnden Z-Scheiben und Costameren verbindet. Über Interaktionen mit sarkomerischen und membranassoziierten Proteinen unterstützt N-RAP die Organisation der kontraktilen Architektur sowie mechanotransduktive Prozesse, die die Differenzierung und Stabilität von Muskelzellen prägen. Veränderte NRAP-Expression oder -Varianten wurden in genetischen sowie remodelingbedingten Kontexten mit Funktionsstörungen der Herz- und Skelettmuskulatur in Verbindung gebracht, wodurch NRAP für Signalwege relevant ist, die die Aufrechterhaltung der Sarkomere, die Anpassung an Stress und muskelspezifische Genprogramme steuern. NRAP wird daher häufig in Modellen für Myopathien und Kardiomyopathien untersucht sowie in Systemen, die zytoskelettales Remodeling und Muskelreifung analysieren.

N-RAP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NRAP-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

N-RAP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NRAP-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NRAP-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen N-RAP-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NRAP-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von N-RAP-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des N-RAP-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NRAP-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.