MYH6 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400351-ACT

MYH6 kodiert die kardiale Alpha-Myosin-Schwerkette, einen zentralen Bestandteil des dicken Myosin‑II-Filaments, das die Sarkomerverkürzung durch ATP-abhängiges Aktin–Myosin-Querbrückenzyklisieren antreibt. Im menschlichen Myokard trägt MYH6 über Interaktionen mit regulatorischen und strukturellen sarkomerischen Proteinen zur Kontraktionskinetik, Kraftentwicklung und koordinierten Erregungs‑Kontraktions‑Kopplung bei. Die MYH6-Expression und das Isoformgleichgewicht werden während der Entwicklung und als Reaktion auf hämodynamischen Stress streng reguliert und sind damit mit Signalwegen verknüpft, die die Myofibrillogenese und das kardiale Remodeling steuern. Genetische Varianten oder eine Fehlregulation von MYH6 wurden mit erblichen Kardiomyopathien und kongenitalen kardialen Phänotypen in Verbindung gebracht, weshalb MYH6 häufig Ziel mechanistischer Studien zur Herzfunktion ist.

MYH6 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MYH6-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MYH6 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MYH6-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MYH6-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MYH6-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MYH6-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MYH6-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MYH6-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MYH6-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.