MuRF1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400797-ACT

TRIM63 kodiert MuRF1, eine muskelspezifische RING-Finger-E3-Ubiquitin-Ligase, die während des Umbaus von Skelett- und Herzmuskel den selektiven proteasomalen Abbau sarkomerischer und myofibrillärer Proteine fördert. MuRF1 verknüpft die Aktivität des Ubiquitin-Proteasom-Systems mit stressresponsiven Signalwegen, darunter FOXO-abhängige Transkriptionsprogramme und katabole Pfade, die die Proteinhomöostase und die kontraktile Funktion regulieren. Eine veränderte TRIM63/MuRF1-Expression ist mit Phänotypen der Muskelatrophie sowie mit Umbauprozessen assoziiert, wie sie bei chronischen Erkrankungen und in Inaktivitäts-/Entlastungssituationen beobachtet werden, und wird häufig als molekularer Effektor eines gestörten Proteostase-Gleichgewichts untersucht. Als Regulator der Myofibrillenstabilität bietet MuRF1 einen mechanistischen Ansatzpunkt, um Signalwege zu untersuchen, die metabolischen Stress, Entzündung und strukturelle Anpassungen der Muskulatur miteinander verknüpfen.

MuRF1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TRIM63-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MuRF1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TRIM63-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TRIM63-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MuRF1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TRIM63-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MuRF1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MuRF1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TRIM63-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.