Plásmido CRISPR de Activación (h) Munc13-4: sc-404319-ACT

UNC13D codifica Munc13-4, un factor de cebado esencial para la exocitosis regulada por Ca²⁺ de los gránulos citotóxicos y otros lisosomas secretores en células inmunitarias. Munc13-4 coordina el acoplamiento y la fusión de vesículas al regular el ensamblaje del complejo SNARE, respaldando vías que controlan la desgranulación, el tráfico de membranas y la secreción regulada. La alteración de la función de UNC13D interrumpe la actividad citolítica de las células NK y de los linfocitos T citotóxicos, y se asocia con síndromes de desregulación inmunitaria caracterizados por una liberación deficiente de gránulos. Como resultado, UNC13D se estudia con frecuencia en el contexto de la función efectora de los linfocitos, los puntos de control del transporte vesicular y la señalización inflamatoria vinculada a defectos de secreción.

Munc13-4 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de UNC13D sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Munc13-4 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus UNC13D en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional UNC13D, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Munc13-4. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo UNC13D y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Munc13-4 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Munc13-4 en células tumorales con expresión de UNC13D silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.