MTHFD1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403353-ACT

O MTHFD1 humano codifica uma enzima citosólica, trifuncional e dependente de folato que catalisa a interconversão entre 10-formil-, 5,10-meteníl- e 5,10-metilen-tetraidrofolato, fornecendo unidades de um carbono necessárias para a biossíntese de novo de purinas e timidilato e para reações de metilação. Ao acoplar o metabolismo do folato à produção de nucleotídeos, o MTHFD1 sustenta a replicação e o reparo do DNA, bem como a progressão do ciclo celular, especialmente em condições de elevada demanda proliferativa. A desregulação do metabolismo de um carbono tem sido associada à instabilidade genômica e a estados epigenéticos alterados, tornando o MTHFD1 um alvo frequentemente estudado na reprogramação metabólica e na adaptação ao estresse. A variação genética ou a expressão alterada de MTHFD1 também está associada a fenótipos relacionados ao folato e à suscetibilidade a distúrbios que envolvem desequilíbrio de nucleotídeos e disponibilidade reduzida de doadores de metila.

MTHFD1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MTHFD1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

MTHFD1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MTHFD1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MTHFD1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de MTHFD1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MTHFD1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de MTHFD1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via MTHFD1 em células tumorais com expressão de MTHFD1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.