MLH3 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-432245-ACT

Mlh3 kodiert MLH3, einen DNA-Mismatch-Repair-Faktor der MutL-Familie, der mit MLH1 einen Heterodimer bildet und über Mismatch-Reparatur und meiotische Rekombination zur Erhaltung des Genoms beiträgt. Während der Meiose fördert MLH1–MLH3 die Bildung von Klasse‑I-Crossovers, während es in somatischen Zellen an der postreplikativen Überwachung beteiligt ist, die die Anhäufung von Mutationen begrenzt und die chromosomale Stabilität erhält. MLH3 ist zudem in Signalwege eingebunden, die auf Replikationsstress und DNA-Schäden reagieren, und verknüpft damit die Reparaturkapazität mit dem Fortschreiten des Zellzyklus. Eine veränderte MLH3-Funktion wurde mit Defekten der Mismatch-Reparatur, Phänotypen genomischer Instabilität und einer Anfälligkeit für mutationsgetriebene Krankheitsprozesse in Verbindung gebracht, die für die Krebsbiologie sowie die Forschung zur Reproduktionsgenetik relevant sind.

MLH3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Mlh3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MLH3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Mlh3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Mlh3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MLH3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Mlh3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MLH3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MLH3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Mlh3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.