Mfn2/Mitofusin 2 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-431291-ACT

Mouse Mfn2 (Mitofusin 2) ist eine konservierte GTPase der äußeren Mitochondrienmembran, die die mitochondriale Fusion vermittelt und die Architektur des mitochondrialen Netzwerks mit dem zellulären Stoffwechselzustand koordiniert. Über die Fusion hinaus trägt MFN2 an mitochondrienassoziierten Membranen zur Kopplung von endoplasmatischem Retikulum und Mitochondrien bei und beeinflusst dadurch den Kalziumaustausch, den Lipidtransport und die Stresssignalgebung. Diese Funktionen überschneiden sich mit Signalwegen, die die oxidative Phosphorylierung, die Homöostase reaktiver Sauerstoffspezies und die mitochondriale Qualitätskontrolle steuern, wodurch Mfn2 zu einem zentralen Knotenpunkt in Netzwerken der Bioenergetik und der Organellenkommunikation wird. Eine Fehlregulation der MFN2-Aktivität und veränderte mitochondriale Dynamik werden mit Neurodegeneration, kardiometabolischer Dysfunktion und peripheren neuropathierelevanten Phänotypen in Verbindung gebracht, was ihren Einsatz in der mechanistischen Krankheitsmodellierung unterstützt.

Mfn2/Mitofusin 2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Mfn2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Mfn2/Mitofusin 2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Mfn2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Mfn2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Mfn2/Mitofusin 2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Mfn2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Mfn2/Mitofusin 2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Mfn2/Mitofusin 2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Mfn2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.