Plasmide CRISPR d'Activation (m) METTL3: sc-425096-ACT

Mettl3 code pour METTL3, le cœur catalytique du complexe de méthyltransférase de l’ARN N6‑méthyladénosine (m6A), qui dépose des marques m6A sur les ARNm et d’autres ARN afin de réguler l’épissage, l’export nucléaire, l’efficacité de traduction et la stabilité des ARN. Grâce à sa coordination avec des cofacteurs tels que METTL14 et WTAP, ainsi qu’avec les « lecteurs » et « effaceurs » de m6A en aval, METTL3 influence des programmes d’expression génique qui contrôlent la progression du cycle cellulaire, la différenciation et les réponses au stress. Dans des systèmes murins, une activité METTL3 modifiée a été associée à des changements dans les décisions de destinée des cellules hématopoïétiques et immunitaires, dans des processus de neurodéveloppement et dans la régulation métabolique, ce qui reflète son impact étendu sur les voies de maturation et de traitement des ARN. Une signalisation m6A dérégulée est également liée à des états transcriptionnels oncogéniques et inflammatoires, faisant de Mettl3 une cible largement utilisée pour étudier le contrôle épitranscriptomique de phénotypes pertinents pour les maladies.

METTL3 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Mettl3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

METTL3 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Mettl3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Mettl3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de METTL3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Mettl3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de METTL3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie METTL3 dans les cellules tumorales présentant une expression de Mettl3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.