METTL3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404029-ACT

METTL3 kodiert den katalytischen Kern des mRNA‑N6‑Methyladenosin-(m6A)-„Writer“-Komplexes und wirkt typischerweise zusammen mit METTL14 und WTAP, um m6A auf kodierenden und nichtkodierenden RNAs zu installieren. Diese epitranskriptomische Modifikation beeinflusst das Spleißen von Prä‑mRNA, den mRNA‑Export, die Stabilität und die Translation und formt damit Genexpressionsprogramme, die den Zellzyklus, die Festlegung von Zelllinien (Lineage Specification) und stressadaptive Antworten steuern. Die METTL3‑abhängige m6A‑Markierung greift in Signalwege ein, die den RNA‑Stoffwechsel, die Ribosomenbiogenese und die signalabhängige Umgestaltung von Transkripten regulieren. Eine fehlregulierte METTL3‑Aktivität und veränderte m6A‑Landschaften wurden in verschiedenen krankheitsrelevanten Kontexten mit aberranter Proliferation und Differenzierung in Verbindung gebracht, was METTL3 als mechanistischen Knotenpunkt für Studien der RNA‑Biologie unterstützt.

METTL3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen METTL3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

METTL3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des METTL3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der METTL3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen METTL3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native METTL3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von METTL3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des METTL3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem METTL3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.