MEK-2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402732-ACT

MAP2K2 kodiert MEK-2, eine dual-spezifische MAPK-Kinase, die ERK1/2 phosphoryliert und aktiviert und so mitogen- und wachstumsfaktorabhängige Signalweiterleitung vermittelt. Als zentraler Knotenpunkt der RAS–RAF–MEK–ERK-Kaskade steuert MEK-2 Zellzyklusprogression, Differenzierung, Überleben und adaptive Transkriptionsprogramme und integriert dabei Signale von Rezeptor-Tyrosinkinasen sowie Stressreize. Eine Fehlregulation der MAP2K2/MEK-2-Aktivität trägt zu einer abweichenden ERK-Signalweg-Ausgabe bei, die mit onkogener Signalgebung, Entwicklungsstörungen und veränderten Entzündungsreaktionen in Zusammenhang steht. In humanen Modellsystemen wird die Modulation von MAP2K2 häufig genutzt, um Signalwegdynamik, Feedback-Kontrolle und das Crosstalk mit PI3K/AKT- sowie JNK/p38-Signalwegen zu untersuchen.

MEK-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MAP2K2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MEK-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MAP2K2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MAP2K2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MEK-2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MAP2K2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MEK-2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MEK-2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MAP2K2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.