Plasmide CRISPR d'Activation (m) MDA5: sc-427977-ACT

Le gène murin *Ifih1* code MDA5 (IFIH1), une hélicase à ARN cytosolique de la famille DExD/H-box qui détecte les longs ARN double brin produits lors de la réplication virale ainsi que d’autres sources d’ARN anormaux. Après liaison au ligand, MDA5 transmet le signal via l’adaptateur MAVS afin d’activer les voies IRF3/IRF7 et NF-κB, induisant les interférons de type I et les gènes stimulés par les interférons, qui façonnent les réponses immunitaires innée et adaptative. Cet axe de détection de l’ARN influence la restriction antivirale, les programmes de cytokines inflammatoires et le dialogue avec l’autophagie ainsi que la dynamique des granules de stress. Une activité dérégulée de MDA5 et de la signalisation des interférons a été associée à des interféronopathies et à une inflammation de type auto-immune, et s’avère également pertinente pour la détection immunitaire des tumeurs et les interactions hôte–pathogène dans des modèles expérimentaux.

MDA5 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Ifih1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MDA5 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Ifih1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Ifih1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MDA5. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Ifih1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MDA5 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MDA5 dans les cellules tumorales présentant une expression de Ifih1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.