Plasmide CRISPR d'Activation (h) MCM5: sc-401980-ACT

MCM5 code une sous-unité essentielle du complexe hélicase de maintenance des minichromosomes (MCM2–7), qui autorise les origines de réplication et assure le déroulement de l’ADN pendant la phase S. En coordonnant l’initiation aux origines et la progression des fourches de réplication, MCM5 contribue au maintien de la stabilité du génome et soutient des transitions ordonnées du cycle cellulaire via les voies de réplication de l’ADN et de contrôle des points de contrôle (checkpoints). Une expression dérégulée de MCM5 est fréquemment associée à des états d’hyperprolifération et à des signatures de stress réplicatif observées dans de multiples contextes de recherche sur le cancer et l’instabilité génomique. Son rôle central dans la synthèse de l’ADN fait également de MCM5 une cible pertinente pour étudier les conflits réplication–transcription et les réponses cellulaires aux fourches bloquées.

MCM5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MCM5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MCM5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MCM5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MCM5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MCM5. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MCM5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MCM5 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MCM5 dans les cellules tumorales présentant une expression de MCM5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.