MB67 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401537-ACT

NR1I3 codifica il recettore nucleare MB67 (CAR), un fattore di trascrizione responsivo ai ligandi che regola il rilevamento degli xenobiotici e le risposte metaboliche adattative nelle cellule umane. Una volta attivato, MB67 forma un eterodimero con RXR e si lega a elementi regolatori per controllare l’espressione di enzimi e trasportatori coinvolti nel metabolismo dei farmaci, integrando vie quali la biotrasformazione mediata dal citocromo P450, le reazioni di coniugazione e l’omeostasi degli acidi biliari e della bilirubina. Attraverso il crosstalk con reti di segnalazione infiammatorie e metaboliche, NR1I3 influenza le risposte allo stress epatocellulare e la gestione sistemica di lipidi e glucosio. Un’attività disregolata di NR1I3 è stata associata alla variabilità interindividuale nella risposta ai farmaci e alla suscettibilità a fenotipi metabolici e correlati al fegato, a supporto del suo impiego in studi meccanicistici sulla detossificazione e sulla regolazione endocrino-metabolica.

MB67 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NR1I3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MB67 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NR1I3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NR1I3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MB67. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NR1I3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MB67 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MB67 nelle cellule tumorali con espressione di NR1I3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.