MaxiKβ CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403096-ACT

KCNMB1 kodiert die β1‑Hilfsuntereinheit großleitfähiger, calcium‑ und spannungsaktivierter Kaliumkanäle (BK/MaxiK), die gemeinhin als MaxiKβ bezeichnet wird. Durch die Erhöhung der Calciumsensitivität des Kanals und die Veränderung der Gating‑Kinetik stimmt MaxiKβ die Membranerregbarkeit und den Kaliumausstrom in glatter Muskulatur und anderen erregbaren Geweben ab und beeinflusst dadurch den Gefäßtonus, die Reaktivität der Atemwege und die zelluläre Calciumhomöostase. Diese modulierende Aktivität verbindet KCNMB1 mit Signalprozessen, die intrazelluläre Ca2+‑Dynamik mit dem Membranpotenzial verknüpfen, einschließlich Signalwegen, die die Kopplung von Kontraktion und Relaxation sowie eine reizabhängige Hyperpolarisation steuern. Eine veränderte BK‑Kanal‑Regulation und Varianten in KCNMB1 wurden im Kontext kardiovaskulärer und glattmuskelbezogener Phänotypen untersucht, was seine Relevanz für mechanistische Arbeiten zur Ionenkanalregulation und zur Biologie erregbarkeitsassoziierter Erkrankungen unterstreicht.

MaxiKβ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen KCNMB1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MaxiKβ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des KCNMB1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der KCNMB1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MaxiKβ-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native KCNMB1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MaxiKβ-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MaxiKβ-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem KCNMB1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.