LRF/Pokemon CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402016-ACT

ZBTB7A kodiert den Transkriptionsfaktor LRF/Pokemon, ein BTB/POZ-Zinkfingerprotein, das Genexpressionsprogramme reguliert, die Zellschicksal, Proliferation und Differenzierung steuern. LRF/Pokemon ist an chromatinassoziierter transkriptioneller Repression und Aktivierung beteiligt, beeinflusst Linienentscheidungen in hämatopoetischen und anderen entwicklungsbiologischen Kontexten und überschneidet sich dabei mit Signalwegen, die die Zellzykluskontrolle und Stressantworten regulieren. Eine dysregulierte ZBTB7A-Aktivität wurde mit veränderten Transkriptionsnetzwerken in der Krebsbiologie sowie mit Störungen der erythroiden und der Immunzell-Entwicklung in Verbindung gebracht, was ZBTB7A zu einem nützlichen Knotenpunkt für die Untersuchung onkogener Transkriptionsfaktor-Schaltkreise macht. Die Untersuchung der ZBTB7A-Funktion unterstützt mechanistische Arbeiten zur Promotor-/Enhancer-Regulation, zu epigenetischen Zustandsübergängen und zu kontextabhängiger transkriptioneller Umverdrahtung.

LRF/Pokemon Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ZBTB7A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

LRF/Pokemon Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ZBTB7A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ZBTB7A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen LRF/Pokemon-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ZBTB7A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von LRF/Pokemon-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des LRF/Pokemon-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ZBTB7A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.