Plasmide CRISPR d'Activation (h) LPAAT-β: sc-405045-ACT

AGPAT2 code la lysophosphatidate acyltransférase bêta (LPAAT-β), une enzyme associée au réticulum endoplasmique qui catalyse l’acylation de l’acide lysophosphatidique pour former l’acide phosphatidique, un intermédiaire clé de la biosynthèse des glycérophospholipides et des triacylglycérols. En contrôlant la disponibilité de l’acide phosphatidique, LPAAT-β influence la biogenèse membranaire, la formation des gouttelettes lipidiques et des processus de signalisation médiés par les lipides, à l’interface du stress métabolique et de l’homéostasie des organites. L’activité d’AGPAT2 est étroitement liée au stockage lipidique des adipocytes et à l’équilibre énergétique systémique, et des variants perte de fonction sont associés à la lipodystrophie généralisée congénitale et à une dérégulation métabolique sévère. Ces caractéristiques font d’AGPAT2 une cible pertinente pour étudier le remodelage lipidique, l’adipogenèse et les perturbations liées aux maladies du métabolisme des phospholipides.

LPAAT-β Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de AGPAT2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

LPAAT-β Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus AGPAT2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription AGPAT2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de LPAAT-β. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus AGPAT2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de LPAAT-β au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie LPAAT-β dans les cellules tumorales présentant une expression de AGPAT2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.