LOX CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400973-ACT

Humanes LOX (Lysyloxidase) kodiert eine sekretierte, kupferabhängige Aminoxidase, die die oxidative Desaminierung von Lysinresten in Kollagen und Elastin katalysiert. Dabei entstehen reaktive Aldehyde, die eine kovalente Quervernetzung einleiten und so die extrazelluläre Matrix stabilisieren. Über die Regulation von Matrixsteifigkeit und -architektur beeinflusst LOX Zelladhäsion, Migration, Mechanotransduktion und Programme des Gewebeumbaus, die mit Wundheilung und Fibrose verknüpft sind. Die LOX-Aktivität überschneidet sich mit hypoxieresponsiver Signalgebung und Signalwegen der Organisation der extrazellulären Matrix, die entzündliche und stromale Antworten prägen. Eine fehlregulierte LOX-Expression wurde mit pathologischem Matrixumbau in fibrotischen Erkrankungen sowie mit dem Remodeling der Tumormikroumgebung in Verbindung gebracht, was LOX als mechanistischen Knotenpunkt in der Biologie der extrazellulären Matrix unterstreicht.

LOX Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen LOX-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

LOX Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des LOX-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der LOX-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen LOX-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native LOX-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von LOX-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des LOX-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem LOX-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.