Loricrin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402452-ACT

Das menschliche LOR-Gen kodiert Loricrin, ein sehr häufig vorkommendes Strukturprotein der verhornenden Zellhülle (cornified envelope), das während der terminalen Keratinozytendifferenzierung die Ausbildung der epidermalen Barriere unterstützt. Loricrin wird durch Transglutaminasen umfangreich quervernetzt und integriert sich mit anderen Komponenten der Zellhülle, um das Stratum corneum zu festigen und die Gewebewiderstandsfähigkeit zu erhalten. Seine Expression ist in epidermale Differenzierungsprogramme eingebunden, die Keratinisierung und Kornifizierung umfassen, einschließlich transkriptioneller Netzwerke, die Gene der späten Differenzierung regulieren. Eine fehlregulierte LOR-Expression oder eine veränderte Assemblierung der verhornenden Zellhülle geht mit einer beeinträchtigten Barrierefunktion einher und wurde mit erblichen sowie entzündlichen Hauterkrankungen in Verbindung gebracht, was LOR für Studien zur epidermalen Homöostase und zu Krankheitsmechanismen relevant macht.

Loricrin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen LOR-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Loricrin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des LOR-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der LOR-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Loricrin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native LOR-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Loricrin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Loricrin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem LOR-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.