Plasmide CRISPR d'Activation (h) LOC729974: sc-418913-ACT

RFPL4AL1 code la protéine humaine LOC729974, un membre de la famille RFPL, dont on prévoit qu’elle participe à des interactions protéine–protéine nucléaires et à la régulation transcriptionnelle via des domaines de type doigt de zinc/RING. Bien que ce locus ne soit pas aussi largement annoté que les paralogues RFPL canoniques, les gènes de la famille RFPL ont été associés au contrôle de la progression du cycle cellulaire, à des processus liés à la chromatine et à une régulation dépendante du contexte des programmes d’expression génique. Les profils d’expression rapportés pour les membres de la famille RFPL suggèrent des rôles dans les tissus reproducteurs et la signalisation du développement, ce qui justifie l’étude de LOC729974 dans des modèles de spécification de lignée et de différenciation. Une dérégulation de gènes RFPL apparentés a été observée dans des contextes prolifératifs et oncogéniques, faisant de LOC729974 une cible utile pour explorer des réseaux transcriptionnels pertinents pour la stabilité du génome et des phénotypes de croissance aberrants.

LOC729974 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RFPL4AL1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

LOC729974 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RFPL4AL1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RFPL4AL1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de LOC729974. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RFPL4AL1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de LOC729974 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie LOC729974 dans les cellules tumorales présentant une expression de RFPL4AL1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.