LOC729974 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-418913-ACT

RFPL4AL1 codifica a proteína humana LOC729974, um membro da família RFPL que se prevê participar em interações proteína–proteína no núcleo e na regulação transcricional por meio de domínios do tipo dedo de zinco/RING. Embora este locus não esteja tão extensamente curado quanto os parálogos canónicos de RFPL, genes da família RFPL têm sido associados ao controlo da progressão do ciclo celular, a processos ligados à cromatina e à regulação dependente do contexto de programas de expressão génica. Padrões de expressão descritos para membros da família RFPL sugerem funções em tecidos reprodutivos e na sinalização do desenvolvimento, fornecendo uma base para estudar a LOC729974 em modelos de especificação de linhagem e de diferenciação. A desregulação de genes RFPL relacionados foi observada em contextos proliferativos e oncogénicos, tornando a LOC729974 um alvo útil para investigar redes transcricionais relevantes para a estabilidade do genoma e para fenótipos de crescimento aberrante.

LOC729974 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RFPL4AL1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

LOC729974 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RFPL4AL1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RFPL4AL1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de LOC729974. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RFPL4AL1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de LOC729974 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via LOC729974 em células tumorais com expressão de RFPL4AL1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.