Plásmido CRISPR de Activación (h) LAT1: sc-401609-ACT

SLC7A5 codifica el transportador humano de aminoácidos de tipo L 1 (LAT1), un transportador de alta afinidad que, junto con la cadena pesada SLC3A2 (CD98), media la captación de aminoácidos neutros de gran tamaño como la leucina. Al controlar la disponibilidad intracelular de aminoácidos, LAT1 favorece la detección de nutrientes y el metabolismo anabólico, e influye en redes de señalización como mTORC1 y las vías de respuesta integrada al estrés, que acoplan el transporte con el crecimiento y la proteostasis. La actividad de LAT1 se estudia con frecuencia en contextos de reprogramación metabólica, biología del transporte en barreras y fenotipos proliferativos en los que el flujo de aminoácidos limita la capacidad biosintética. La expresión desregulada de SLC7A5 se ha asociado con una dependencia alterada de nutrientes y vulnerabilidades vinculadas a transportadores en múltiples modelos de enfermedad, lo que la convierte en un punto de entrada ampliamente utilizado para investigar la señalización impulsada por aminoácidos.

LAT1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de SLC7A5 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

LAT1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus SLC7A5 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional SLC7A5, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de LAT1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo SLC7A5 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de LAT1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía LAT1 en células tumorales con expresión de SLC7A5 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.