LAPTM5 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404229-ACT

LAPTM5 (lysosomales Transmembranprotein 5) ist ein in hämatopoetischen Zellen besonders stark exprimiertes lysosomales/endosomales Membranprotein, das den intrazellulären Transport und die Abschwächung von Signalwegen in Immunzellen reguliert. Es ist an vesikelvermitteltem Transport sowie am lysosomenabhängigen Abbau von Signalkomponenten beteiligt und trägt dazu bei, rezeptornahe Signalwege wie die Antigenrezeptor-Signalgebung, Zytokinantworten und den ubiquitinabhängigen Abbau zu formen. Aufgrund seiner Funktionen in der endolysosomalen Organisation und der Homöostase der Immunzell-Signalgebung ist LAPTM5 relevant für Studien zur Leukozytenaktivierung, zur Regulation von Entzündungen und zu fehlregulierten Signalprogrammen, wie sie in verschiedenen hämatologischen Krankheitskontexten beobachtet werden. Seine Expression und Funktion werden zudem genutzt, um zu untersuchen, wie lysosomengekoppelter Transport Zellschicksalsentscheidungen und die Proteostase in Immunzelllinien beeinflusst.

LAPTM5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen LAPTM5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

LAPTM5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des LAPTM5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der LAPTM5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen LAPTM5-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native LAPTM5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von LAPTM5-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des LAPTM5-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem LAPTM5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.