KV1.3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403814-ACT

KCNA3 kodiert den humanen spannungsabhängigen Kaliumkanal KV1.3, eine Membranleitfähigkeit, die dazu beiträgt, das Ruhemembranpotenzial festzulegen und das Aktionspotenzial-Feuern in erregbaren und nicht erregbaren Zellen zu formen. Durch die Regulation des Kaliumausstroms beeinflusst KV1.3 calciumabhängige Signalprogramme, die Aktivierung, Proliferation und Zytokinproduktion steuern, und verknüpft damit die Ionenhomöostase mit nachgeschalteten transkriptionellen Antworten. Die KV1.3-Aktivität überschneidet sich mit der Rezeptorsignalgebung von Immunzellen, der mitochondrialen Bioenergetik und redoxsensitiven Signalwegen, die die Aktivierungsschwellen von Zellen fein einstellen. Eine fehlregulierte KCNA3-/KV1.3-Expression oder -Funktion wurde mit immunvermittelten Entzündungen und veränderten Proliferationszuständen in Verbindung gebracht, was ihre Relevanz für mechanistische Studien in der Immunologie und krankheitsassoziierten zellulären Phänotypen unterstreicht.

KV1.3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen KCNA3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

KV1.3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des KCNA3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der KCNA3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen KV1.3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native KCNA3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von KV1.3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des KV1.3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem KCNA3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.