kpm CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404134-ACT

Humanes LATS2 kodiert eine zentrale Serin/Threonin-Kinase des Hippo-Signalwegs, die die Zellproliferation begrenzt und Apoptose fördert, indem sie die transkriptionellen Koaktivatoren YAP/TAZ reguliert. Über eine phosphorylierungsabhängige Kontrolle der nukleären YAP/TAZ-Aktivität trägt LATS2 zur Aufrechterhaltung der Gewebehomöostase, der Kontaktinhibition und der Integrität von Zellzyklus-Checkpoints bei; zudem bestehen zusätzliche Verknüpfungen zur Zentrosomenbiologie und zu Stressantworten. Eine veränderte LATS2-Funktion oder eine Fehlregulation des Hippo-Signalwegs ist in verschiedensten krankheitsrelevanten Kontexten häufig mit abnormer Wachstumskontrolle und genomischer Instabilität assoziiert, weshalb LATS2 einen intensiv untersuchten Knotenpunkt in Tumorsuppressor-Netzwerken darstellt. Als Kinase an einem Konvergenzpunkt des Signalwegs wird LATS2 außerdem genutzt, um das Crosstalk zwischen Hippo-Signalgebung, Zytoskelettdynamik und transkriptionellen Programmen zu untersuchen, die epithelial-mesenchymale Eigenschaften steuern.

kpm Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen LATS2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

kpm Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des LATS2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der LATS2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen kpm-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native LATS2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von kpm-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des kpm-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem LATS2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.