Ki67 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400081-ACT

MKI67 kodiert das humane Protein Ki67, einen nukleären Proliferationsmarker, der während aller aktiven Phasen des Zellzyklus exprimiert wird und in ruhenden Zellen weitgehend fehlt. Ki67 trägt zur höherstufigen Chromatinorganisation bei und ist für eine korrekte Architektur der mitotischen Chromosomen erforderlich; damit unterstützt es Prozesse wie die Zellzyklusprogression, chromatinbezogene Dynamiken im Zusammenhang mit der DNA-Replikation und die Mitose. Als Maß für den Proliferationsindex wird Ki67 häufig in Studien zur Gewebehomöostase und zur Kinetik von Zellpopulationen eingesetzt, und eine veränderte MKI67-Expression ist in der Krebsbiologie und anderen hyperproliferativen Zuständen häufig mit einer dysregulierten Proliferation assoziiert. Die experimentelle Modulation von MKI67 unterstützt Untersuchungen zu proliferationsgekoppelten Transkriptionsprogrammen und Signalwegen der Zellzykluskontrolle.

Ki67 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MKI67-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Ki67 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MKI67-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MKI67-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Ki67-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MKI67-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Ki67-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Ki67-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MKI67-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.