KA2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405272-ACT

GRIK5 kodiert die Kainat-Rezeptoruntereinheit KA2, einen obligaten Partner, der sich mit anderen Kainat-Rezeptoruntereinheiten zu funktionellen ionotropen Glutamatrezeptoren an exzitatorischen Synapsen zusammenlagert. KA2-haltige Rezeptoren tragen zur schnellen synaptischen Transmission und zur aktivitätsabhängigen Plastizität bei, indem sie den Kationenfluss regulieren und die neuronale Erregbarkeit mitprägen; damit verknüpft GRIK5 glutamaterge Signalnetzwerke mit calciumabhängigen nachgeschalteten Signalwegen. Über Effekte auf synaptische Integration sowie das Erregungs-/Hemmungs-Gleichgewicht auf Netzwerkebene wurde eine veränderte KA2-Expression oder Rezeptorzusammensetzung im Kontext neuroentwicklungsbedingter und neuropsychiatrischer Phänotypen sowie einer erhöhten Anfallsneigung untersucht. Diese Eigenschaften machen GRIK5 zu einem nützlichen Ansatzpunkt, um Rezeptorassemblierung, -transport (Trafficking) und exzitatorische Neurotransmission in humanen Zellmodellen zu untersuchen.

KA2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GRIK5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

KA2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GRIK5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GRIK5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen KA2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GRIK5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von KA2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des KA2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GRIK5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.