Ini1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-423027-ACT

Mouse Smarcb1 kodiert Ini1 (auch bekannt als SNF5/BAF47), eine zentrale Untereinheit des ATP‑abhängigen Chromatin‑Remodelling‑Komplexes SWI/SNF (BAF), der die Nukleosomenpositionierung und Transkriptionsprogramme reguliert, die den Zellzyklusverlauf, die Festlegung von Zelllinien (Lineage Specification) und die Differenzierung steuern. Ini1 trägt zur Koordination der Zugänglichkeit von Enhancern und Promotoren bei und verknüpft Signalinputs mit dem Chromatinzustand, um Genexpressionsnetzwerke zu modulieren, die an Entwicklung und DNA‑Schadensantworten beteiligt sind. Eine Störung der SMARCB1/INI1‑Funktion ist mit veränderter epigenetischer Regulation und aberranter Proliferation assoziiert, und der Verlust von SWI/SNF‑Untereinheiten ist ein wiederkehrendes Merkmal bei zahlreichen Tumorarten. Als zentraler Chromatinregulator wird Smarcb1 häufig in Signalwegen untersucht, die das Gleichgewicht zwischen transkriptioneller Repression und Aktivierung, die Checkpoint‑Kontrolle und die Chromatinarchitektur steuern.

Ini1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Smarcb1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Ini1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Smarcb1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Smarcb1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Ini1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Smarcb1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Ini1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Ini1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Smarcb1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.