INF2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-410096-ACT

Humanes INF2 (inverted formin 2) kodiert einen Aktin-Nukleationsfaktor, der die Signalübertragung von Rho-Familien-GTPasen mit der dynamischen Umgestaltung des Aktinzytoskeletts und damit verbundenen Membrantransportprozessen koppelt. INF2 ist an Prozessen wie der Organisation von Stressfasern, der Regulation von Kontakten zwischen endoplasmatischem Retikulum und Mitochondrien sowie der mitochondrialen Spaltung (Fission) durch koordinierte Aktinpolymerisation beteiligt. Eine veränderte INF2-Aktivität wurde mit einer gestörten Homöostase des Zytoskeletts und der Zellpolarität in Verbindung gebracht und ist mit krankheitsrelevanten Phänotypen in renalen Podozyten und peripheren Neuronen assoziiert. Als Knotenpunkt eines Signalwegs, der Aktindynamik mit Organellenfunktion integriert, wird INF2 routinemäßig in Modellen zytoskelettaler Erkrankungen und des Umbaus mitochondrialer Netzwerke untersucht.

INF2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen INF2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

INF2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des INF2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der INF2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen INF2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native INF2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von INF2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des INF2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem INF2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.