Plasmide CRISPR d'Activation (h) Ihh: sc-401466-ACT

L’« Indian hedgehog » (IHH) code le morphogène sécrété Ihh, un ligand de la famille Hedgehog qui régule les décisions de destin cellulaire et la mise en place des tissus en activant la signalisation PTCH1/SMO et la transcription dépendante de GLI. Ihh est un coordinateur clé de l’ossification endochondrale, de la prolifération et de l’hypertrophie des chondrocytes, ainsi que de la différenciation des ostéoblastes, en s’intégrant aux programmes du développement qui façonnent la croissance du squelette. Une activité dérégulée de la voie IHH est associée à un développement anormal du cartilage et de l’os et a été impliquée dans des processus pathologiques liés à un déséquilibre de la signalisation Hedgehog. Comme les sorties de la voie Hedgehog s’entrecroisent avec des signaux WNT, BMP et MAPK, IHH est fréquemment étudié comme un moteur en amont de la différenciation et de la signalisation du microenvironnement dans des modèles musculosquelettiques et de développement.

Ihh Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de IHH sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Ihh Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus IHH dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription IHH, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Ihh. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus IHH natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Ihh au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Ihh dans les cellules tumorales présentant une expression de IHH silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.